荧光定量pcr技术原理及步骤

　　荧光定量PCR技术是一种在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过实时监测每一个循环产物的荧光信号，从而实现对起始模板的定量及定性分析的技术。荧光定量PCR的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，这些荧光基团会随着PCR反应的进行而释放出荧光信号。通过实时监测这些荧光信号的强度变化，可以反映出PCR反应的进程和结果。具体来说，在PCR反应的指数期，模板的Ct值（即达到设定阈值时的循环数）和该模板的起始拷贝数存在线性关系，因此可以通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再根据样品的Ct值在该曲线上确定其所含起始模板的数量。

　　

　　1、设计并合成引物：这是目标基因引物的设计和合成，确保其特异性和有效性。引物是PCR扩增的关键，它们决定了PCR反应能否成功扩增出目标基因。

　　

　　2、准备反应体系：将引物、模板DNA、荧光标记的探针或染料以及其他必要的反应成分混合在一起，形成PCR反应体系。其中，荧光标记的探针或染料用于后续的荧光检测。

　　

　　3、进行PCR反应：将反应体系置于PCR仪中，按照设定的程序进行PCR扩增。在扩增过程中，荧光信号会随着PCR产物的增加而逐渐增强。

　　

　　4、实时检测和定量：在PCR反应进行的同时，实时监测每个循环结束时的荧光强度。当检测到的荧光信号超过设定的阈值时，记录此时的循环数（Ct值）。Ct值与起始模板的量成反比，即起始模板量越多，Ct值越小。

　　

　　5、数据分析：根据Ct值和标准曲线计算出样品中目标基因的起始拷贝数或相对表达量。这一步骤通常由专门的软件完成。

　　

　　荧光定量PCR技术以其高灵敏度、高特异性以及能够实现实时定量的特点，在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域发挥着重要作用。